Bii o ṣe le ni ilọsiwaju ifamọ ti esi RT-PCR fun wiwa RNA

Ninu ilana ti ṣiṣe awọn iwadii jiini, a nigbagbogbo ba pade awọn ayẹwo RNA ti ko to, fun apẹẹrẹ, fun kikọ ẹkọ awọn èèmọ ẹnu anatomical kekere, paapaa awọn ayẹwo sẹẹli-ẹyọkan, ati awọn apẹẹrẹ ti awọn iyipada jiini kan pato ti a kọwe ni awọn ipele kekere pupọ ninu awọn sẹẹli eniyan.Nitoribẹẹ, fun idanwo COVID-19, ti awọn swabs ko ba wa ni aye to tọ tabi ko to awọn akoko lakoko iṣapẹẹrẹ, iwọn ayẹwo yoo kere pupọ, eyiti o jẹ idi ti Igbimọ Ilera ati Eto Idile ti jade ni ọjọ meji sẹhin ati ṣe idanwo naa, ati pe ti oluṣayẹwo acid nucleic ko gba awọn ayẹwo mẹfa, o le jabo rẹ.

Ifamọ ti reagent jẹ pataki nitori pe a ni iṣoro yii tabi iṣoro yẹn, nitorinaa kini a le ṣe lati mu ifamọ ti RT-PCR dara si?

Ṣaaju ki a to jiroro awọn ojutu ti o ṣeeṣe, jẹ ki a mẹnuba awọn ilolu nla meji pẹlu ipo ti a ṣẹṣẹ mẹnuba.

Ni akọkọ, a ṣe aniyan nipa pipadanu RNA nigba ti a ni awọn nọmba sẹẹli diẹ ninu apẹẹrẹ wa.Ti a ba lo iyapa ibile ati awọn ọna mimọ, gẹgẹbi ọna ọwọn tabi ọna ojoriro acid nucleic, o ṣeeṣe pe awọn ayẹwo diẹ yoo padanu.Ojutu kan ni lati ṣafikun moleku ti ngbe, gẹgẹbi tRNA, ṣugbọn paapaa lẹhinna, ko si iṣeduro pe idanwo imularada wa dara.

Nitorina kini ọna ti o dara julọ?Aṣayan ti o dara fun awọn sẹẹli gbin tabi awọn ayẹwo microanatomical ni lati lo lysis taara.

Ero naa ni lati pin awọn sẹẹli naa fun awọn iṣẹju 5, tu RNA sinu ojutu, lẹhinna da iṣesi naa duro fun awọn iṣẹju 2, lẹhinna ṣafikun lysate taara si ifawewe ikọsilẹ ki RNA ko padanu, ati nikẹhin fi cDNA abajade taara. sinu awọn gidi-akoko lenu.

Ṣugbọn kini ti o ba jẹ pe, nitori aaye ibẹrẹ ti o lopin tabi iye kekere ti ikosile jiini ibi-afẹde, a le tunlo gbogbo RNA ati pe ko tun pese awọn awoṣe to lati gba ifihan akoko gidi to dara?

Ni idi eyi, igbesẹ iṣaju iṣaju le wulo pupọ.

Atẹle jẹ ero lati mu ifamọ pọ si lẹhin gbigbekọ yiyipada.Ṣaaju ki o to bẹrẹ, a nilo lati beere ni isalẹ awọn ibi-afẹde ti a nifẹ si, nitorinaa lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko kan pato fun awọn ibi-afẹde wọnyi fun iṣaju iṣaju.

Eyi le ṣe aṣeyọri nipa ṣiṣẹda alakoko ti o dapọ pẹlu to awọn orisii 100 ti awọn alakoko ati ilana iṣesi ti awọn akoko 10 si 14.Nitorinaa, Adapọ Titunto si pataki ti a ṣe apẹrẹ fun ibeere yii ni a nilo lati ṣaju iṣaju cDNA ti o gba.

Idi fun tito nọmba awọn iyipo laarin 10 ati 14 ni pe nọmba awọn iyipo ti o lopin yii ṣe idaniloju aileto laarin awọn ibi-afẹde lọpọlọpọ, eyiti o ṣe pataki fun awọn oniwadi ti o nilo alaye molikula pipo.

Lẹhin iṣaju iṣaju, a le gba iye nla ti cDNA, ki ifamọ wiwa ni ẹhin-ipari jẹ ilọsiwaju pupọ, ati pe a le paapaa dilute ayẹwo ati ṣe ọpọlọpọ awọn aati PCR gidi-akoko lati yọkuro awọn aṣiṣe laileto ti o ṣeeṣe.